Atlante della traduzione e del decadimento dell'mRNA per i batteri

Nature Microbiology volume 8, pagine 1123–1136 (2023)Citare questo articolo

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La regolazione della stabilità dell'RNA messaggero è fondamentale per l'espressione genica programmata nei batteri ed è ottenuta attraverso una miriade di meccanismi molecolari. Mediante il sequenziamento in massa degli intermedi di decadimento dell'mRNA monofosforilato 5′ (5′P), mostriamo che la degradazione dell'mRNA cotraduzionale è conservata sia tra i batteri Gram-positivi che tra quelli negativi. Dimostriamo che, nelle specie con esonucleasi 5′-3′, l'esoribonucleasi RNasi J segue il ribosoma finale per produrre un'impronta a singolo nucleotide in vivo della posizione 5' del ribosoma. In altre specie prive di esonucleasi 5′-3′, il posizionamento dei ribosomi altera i siti di clivaggio endonucleolitici. Utilizzando il nostro approccio di sequenziamento del metadegradoma (5′P degradome), caratterizziamo gli intermedi di decadimento dell'mRNA 5′P in 96 specie tra cui Bacillus subtilis, Escherichia coli, Synechocystis spp. e Prevotella copri e identificano le risposte di stallo ribosomiale a livello di codone e gene allo stress e al trattamento farmacologico. Applichiamo anche il sequenziamento 5′P a microbiomi clinici e ambientali complessi e dimostriamo che il sequenziamento del metadegradoma fornisce una caratterizzazione posttrascrizionale rapida e specie-specifica delle risposte ai farmaci o alle perturbazioni ambientali. Infine produciamo un atlante degradome per 96 specie per consentire l'analisi dei meccanismi di degradazione dell'RNA nei batteri. Il nostro lavoro apre la strada all’applicazione del sequenziamento del metadegradoma allo studio della regolazione posttrascrizionale in specie non coltivabili e comunità microbiche complesse.

La degradazione e la traduzione dell'RNA messaggero (mRNA) sono strettamente correlate e i cambiamenti nella dinamica dei ribosomi modulano direttamente la stabilità dell'RNA messaggero1,2,3,4. Negli eucarioti, la sintesi proteica e il decadimento dell'mRNA sono collegati dall'esonucleasi 5′–3′ Xrn1, che segue l'ultimo ribosoma di traduzione producendo un'impronta in vivo della sua posizione5,6. La degradazione dell’RNA nei batteri consente l’adattamento ai cambiamenti ambientali, ma la nostra comprensione della degradazione dell’RNA nei batteri è stata ostacolata dalla diversità dei meccanismi di degradazione dell’RNA. Si pensava che la degradazione dell'RNA batterico iniziasse tramite la scissione endonucleolitica seguita da una degradazione 3′–5′7,8,9,10. Sebbene sia stata segnalata l'attività esonucleolitica dell'RNA 5′–3′ della RNasi J in Bacillus subtilis11 e i suoi omologhi in altre specie9, e sia noto che l'efficienza traduzionale modula la stabilità dell'mRNA nei batteri3,12, non comprendiamo come la degradazione cotraduzionale dell'mRNA modelli l'attività batterica degradome o se questo processo differisce nelle specie con meccanismi di degradazione dell'mRNA divergenti.

Per comprendere meglio la regolazione della biologia dell'RNA nei batteri, abbiamo studiato la degradazione dell'mRNA in ceppi batterici di riferimento e microbiomi complessi utilizzando il sequenziamento ottimizzato di intermedi di decadimento dell'mRNA monofosforilati (5′P) (degradome) ottimizzati (5PSeq). Abbiamo esplorato il grado in cui il 5′P presente in natura riflette le dinamiche dei ribosomi in vivo e abbiamo caratterizzato il degradoma 5′P in risposta allo stress ambientale e al trattamento farmacologico in ceppi di riferimento e colture fecali complesse. Abbiamo analizzato i modelli di degradazione dell'mRNA in 96 specie coltivabili e non coltivabili, incluso l'organismo modello B. subtilis, e riportiamo qui i nostri risultati.

Abbiamo analizzato il degradoma dell'mRNA 5′P in singole specie e comunità batteriche complesse utilizzando 5PSeq ottimizzato)5,13,14,15 (Tabelle supplementari 1 e 2 e metodi). Per prima cosa abbiamo studiato il degradoma 5′P degli open reading frames (ORF) in specie con decadimento 5′–3′. B. subtilis codifica l'esonucleasi 5′–3′ RNasi J11. Sebbene l'RNasi J non sia omologa all'XRN1 eucariotico, abbiamo ipotizzato che, attraverso la sua attività di esonucleasi 5′–3′, potrebbe "inseguire" l'ultimo ribosoma di traduzione negli mRNA sottoposti a decadimento cotraduzionale, simile a XRN1 nel lievito5,16. La nostra analisi ha rivelato una periodicità di 3 nucleotidi (nt) di conteggi 5′P (Fig. 1a) con una preferenza 5′P per il secondo nucleotide di ciascun codone (F1), sia a livello di metagene che di singolo gene (Fig. 1a e dati estesi Fig. 1a). Gli intermedi di degradazione 5′P accumulano rispettivamente 11 e 14 nt a monte dei siti di inizio e fine della traduzione, come previsto dai ribosomi ad inizio e fine lenti. Questo modello è analogo ai siti –14 nt dall'inizio e –17 nt dall'arresto nel lievito in gemmazione5,15. Questa dimensione di protezione inferiore di 3 nt può essere spiegata dalla nota differenza nelle dimensioni dei ribosomi tra eucarioti e batteri17. Abbiamo confermato l'associazione degli intermedi di decadimento 5′P con la traduzione dei ribosomi mediante l'applicazione di 5PSeq a frazioni poliribosomiali di gradienti di densità di saccarosio e osservato modelli simili (Dati estesi Fig. 1b). Per dimostrare la sua origine biologica, abbiamo confermato che la frammentazione in vitro dello stesso RNA ha eliminato la periodicità di 3 nt osservata in vivo di> 99,5% (segnale di trasformata rapida di Fourier (FFT) che scende a 0,11) e di impronte di toe associate all'avvio/arresto (Fig .1a). Infine, per indagare se esiste un ruolo per la RNasi J in questo processo, abbiamo ripetuto l'analisi in un ceppo di delezione della RNasi JA di B. subtilis (rnjA). Ciò ha rivelato che l'attività della RNasi JA è alla base del modello di distribuzione 5′P osservato risultante dalla degradazione dell'mRNA cotraduzionale (Fig. 1b).